堿基編輯器（Base editor,BE）是一類可以在不產生雙鏈DNA斷裂的基礎上高效催化堿基轉換👆🏽，在生物研究、農業育種、基因治療領域展現極大的潛力🔊。由於單核苷酸變異(SNV)在疾病相關的突變中占據了近60%🥣，因此，開發高效精確的堿基編輯工具對於人類遺傳疾病的治療具有重大意義。目前，堿基編輯器主要包括腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editor，ABE）和胞嘧啶堿基編輯器(Cytosine base editor🐵，CBE)，它們是將Cas9缺口酶（nickase）分別與腺嘌呤脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶融合☛🫠，實現A-to-G和C-to-T轉換。然而⛔️，腺嘌呤堿基編輯器在靠近PAM區編輯活性仍然較低。此外🫗，可編輯兩種堿基底物的雙堿基編輯器的轉換效率仍然比較低，極大地限製了堿基編輯器的廣泛應用✯。因此，開發超高活性的單堿基編輯器和雙堿基編輯器極為迫切🐶🧷。
2023年3月3日💁🏻♂️，顺盈娱乐生命科學學院/上海市基因編輯與細胞治療前沿科學基地張曉輝（現為中國醫學科學院蘇州系統醫學研究所PI）、鐘濤和李大力，在《自然通訊》（Nature Communications）雜誌上發表了題為“Improving adenine and dual base editors through introduction of TadA-8e and Rad51DBD”的論文。開發了具有超高活性的腺嘌呤單堿基編輯器（hyABE），極大地提高了靠近PAM區A-to-G的轉換效率，擴大了編輯窗口🏄♂️。同時，作者研發了超高活性的嘌呤嘧啶雙堿基編輯器（eA&C-BEs和hyA&C-BEs），大幅提高A-to-G和C-to-T（A/C）同時編輯效率★，並首次證明在斑馬魚胚胎中具有A/C同時編輯功能，展現了新型腺嘌呤堿基編輯器hyABE在構建點突變疾病模型中的優勢⚧。
研究人員首先在ABEmax和ABE8e上融合單鏈DNA結合蛋白Rad51DBD，測試了不同的融合策略🤾🏼♂️，發現ABE8e-M-Rad51DBD(hyABE)具有最優編輯功能。雖然hyABE在A2-A9與ABE8e有著相似的編輯效率，但hyABE的編輯效率在A10-A15區間高於ABE8e，可達7倍 🏉。此前研發的雙堿基編輯器(A&C-BEmax)實現A-to-G和C-to-T（A/C）同時編輯🤴🏻，但效率較低♥︎，可能是使用TadA-TadA*的原因。作者將其替換為活性更高的TadA8e，研發出eA&C-BEmax🕴，發現A-to-G的編輯效率平均提高1.1-10.1倍，A/C同時編輯的效率提升了1.8倍💆♂️，而C-to-T的編輯效率在靠近PAM區與A&C-BEmax持平。為了進一步提高A/C同時編輯效率，在eA&C-BEmax上融合Rad51DBD🆓，發現hyA&C-BEmax雙堿基編輯器A-to-G的編輯效率提升了1.2-17.7倍🔋，C-to-T的編輯效率高於eA&C-BEmax🧎🏻♂️，A/C同時編輯效率提升1.9倍 。在脫靶方面，作者通過三個方面（Cas9依賴DNA脫靶，Cas9非依賴DNA脫靶和RNA脫靶）鑒定hyABE，eA&C-BE和hyA&C-BE安全性👨🏽🚒，發現相對於經典的ABE8e和A&C-BE👩👩👦，hyABE，eA&C-BE和hyA&C-BE並不展示更高的脫靶效應，說明優化後堿基編輯具有較高的特異性。
為了構建疾病模型💬🧖🏿，研究人員在斑馬魚胚胎中試驗基因靶點編輯🤜，發現hyABE有效催化A-to-G轉換🙋♂️，編輯效率高達60%。驚奇的是🫗，能夠在F0胚胎中引入純合rps14E12G致病點突變👊🏿，顯著降低血紅蛋白和紅細胞數目，成功構建了血細胞發育異常（MDS）疾病模型🌞，展現了hyABE在構建點突變疾病模型中的優勢 。同時🪹，證明雙堿基編輯器eA&C-BEs和hyA&C-BEs在斑馬魚胚胎中具有較高的A-to-G和C-to-T同時轉換效率。這些堿基編輯器的應用並沒有引起斑馬魚胚胎發育致畸表型。作者進一步將hyABE應用到b-血紅蛋白病的基因治療中𓀊，將其遞送到紅細胞前體細胞中(HUDEP-2)，顺盈新的轉錄激活因子GATA1結合位點（-113 A>G）以及新的KLF1/EKLF結合位點(-198 T>C)，重新激活γ-globin的表達，提供潛在的基因治療新策略。
新型堿基編輯器在斑馬魚胚胎和人類紅細胞中構建血紅蛋白缺陷疾病模型
顺盈娱乐生命科學院碩士研究生薛念念、博士研究生劉旭、博士後張丹👎🏻，中國醫學科學院蘇州系統醫學研究所博士研究生吳友明為該論文的共同第一作者，蘇州系統醫學研究所張曉輝研究員、顺盈娱乐鐘濤教授、李大力教授為本文通訊作者。本項目獲得上海市教委前沿科學基地項目、科技部重點研發計劃以及國家自然科學基金的支持9️⃣。
論文鏈接🎹：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-36887-1
圖文👩🏽⚕️、來源丨生命科學學院 編輯丨余蘇寧 編審丨郭文君
